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Cofactor: es un componente no proteico que ciertas enzimas necesitan para tener actividad catalítica. Dentro de los cofactores están las coenzimas, que son moléculas orgánicas y los iones inorgánicos (Mg+2, K+). En general los cofactores pueden ser grupos prostéticos de la enzima.
Grupo prostético: no es un aminoácido, pero forma parte de la proteína y está firmemente unido a ella, es decir, no presenta equilibrio de asociación –disociación, por lo tanto si se aísla la proteína se obtiene junto con el grupo prostético. Algunos cofactores y coenzimas son grupos prostéticos y otros no, porque están en proceso de equilibrio de asociación-disociación y obviamente la molécula que tiene unido su cofactor, es la que va a catalizar.
Muchas de estas coenzimas se forman en el organismo a partir de una vitamina, ejemplo: piridoxal-fosfato, la cual es diferente al resto, pero lo mas representativo de ella son las transaminasas o aminotransferasas, las cuales catalizan la transferencia de un grupo amino de un alfa-aminoácido a un grupo alfa-cetoácido. El cofactor, que es una coenzima de las transaminasas (piridoxal-fosfato), sirve porque en esta reacción el grupo amino del aminoácido se traslada hacia al cofactor que va unido al alfa-piridoxal-fosfato, la enzima se une el alfa-cetoácido y el grupo piridoxal-fosfato es trasladado al alfa-cetoácido. Este piridoxal-fosfato es un grupo prostético, las transaminasas tienen firmemente unido el grupo prostético, en cambio un caso donde no es grupo prostético el cofactor, es la reacción de malato-deshidrogenasa del ciclo de Krebs, ahí tenemos el L-malato oxalacetato, aquí se produce una reacción de óxido-reducción, la oxidación se produce cuando pasa de hidroxilo a cetona y la reducción de cetona a hidroxilo. Aquí se presenta la coenzima nucleotídica NAD+ (nicotinamida-adenina-dinucleotido.
Aquí la coenzima no es un grupo prostético, se esta comportando simplemente como si fuera un segundo sustrato, hay una transferencia de electrones y se forma la coenzima en su forma reducida, de ahí ocurre la transformación química del sustrato a producto participando la enzima. Como la reacción química ocurre en el sitio activo con participación de los grupos que tiene la enzima, este estado de transición es diferente que para una reacción no catalizada, es de muy corto tiempo, se forma e inmediatamente se produce la reacción. Entonces ese estado es de alta energía, pero comparándolo con el estado de transición de la reacción sin catálisis, es de menor energía, es un estado de transición en que participan todos los grupos de la enzima.
En el complejo enzima-sustrato, el sustrato se une a la enzima en forma reversible, se puede volver a disociar sin que ocurra reacción.
Aquí se muestra la curva:
Se puede desglosar en la parte en que se une el sustrato a la enzima, se forma el complejo enzima-sustrato, luego ocurre la reacción, la pequeña barrera energética, se forma el complejo enzima–producto y luego el producto disocia produciendo una pequeña energía de activación.
Existen ciertos modelos respecto a la interacción enzima-sustrato:
1.- Modelo llave-cerradura: Emil Fischer, 1890, se preguntaba ¿porque una enzima cataliza la reacción de un compuesto y no de otro?, investigó sobre las reacciones de transformaciones de azúcar, y se imagino de que existe la relación de una llave que sería el sustrato y una cerradura que sería el sitio activo de la enzima, donde se une el sustrato, un sustrato que no corresponde a esa cerradura no se podría unir. El modelo llave-cerradura es correcto, hay una complementariedad entre sustrato y sitio activo, en todo sentido, no solamente de tamaño y forma. También algo muy importante es que el sustrato cuando se une al sitio activo, se tiene que unir gracias a cierto tipo de interacciones, como los puentes de hidrogeno. Tiene que haber una complementariedad entre el grupo que forma el puente dentro del sustrato y el lugar de donde esta el grupo aceptor o dador del hidrogeno que va a formar el puente.
2.- Modelo encaje inducido: Daniel Koshland, 1958. Él hacia cristalografía de proteínas, se conocían las primeras estructuras de las proteínas y ahí surgió la idea de que las proteínas no son rígidas, son macromoléculas que tienen cambios conformacionales. Daniel planteo que cuando se une el sustrato a la enzima, induce un cambio conformacional en la enzima y por lo tanto la estructura del complejo enzima-sustrato es diferente a la estructura de la enzima cuando esta libre. Existen muchos casos en que esto efectivamente se ha podido comprobar, en otros casos ese cambio conformacional es muy pequeño, prácticamente no se ve cuando se hace el estudio, pero algún mínimo cambio tendrá que haber siempre.
¿Cómo ocurre la catálisis enzimática? ¿Qué es lo que ocurre realmente en el sitio activo durante el proceso catalítico y que es lo que logra que la velocidad aumente en un factor de 1 millón? En general son muchos factores que afectan a la vez:
La unión de la enzima al sustrato favorece la reacción, porque el estado de transición (estado de alta energía) es estabilizado por múltiples interacciones débiles entre el sustrato y la enzima, entonces como lo estabiliza el estado de transición es de menor energía. Se piensa que el sitio activo de una enzima tiene que ser más complementario a la estructura del sustrato en el estado de transición, que al sustrato mismo. Debido a que no se puede aislar el complejo enzima-sustrato se habla de interacciones no solo que unen el sustrato a la enzima, sino que otras interacciones que se forman en el estado de transición. En reacciones bimoleculares, los 2 sustratos se unen al sitio activo, primero se une un alfa-aminoácido, entrega su grupo amino al piridoxal-fosfato, se suelta, y luego llega el alfa-cetoácido, el cual recibe el grupo amino y también se suelta, es decir, no están los 2 sustratos unidos simultáneamente. Hay grupos que permiten la unión del sustrato y otros que participan en la catálisis, dentro de estos es muy común:
Catálisis ácido-base: que consiste en un mecanismo en el cual se requiere que el sustrato se protone o se desprotone para que reaccione, entonces en una catálisis acidita, el sustrato se tiene que protonar para que pueda transformarse en producto.
Catálisis básica: se tiene que desprotonar (ciertos grupos de la enzima permite que se protone o se desprotone).
Catálisis covalente: no es tan común, pero los casos que existen son interesantes. La catálisis covalente es una excepción a la regla general, lo habitual es que el sustrato se une reversiblemente al sitio activo por interacciones débiles, que no son enlaces covalentes. En la catálisis covalente se forma un enlace covalente que es de la enzima y parte del sustrato, una parte del sustrato queda unido a través de un enlace covalente al sitio activo en el curso de la reacción, porque después ese enlace covalente vuelve a romperse, en ciertos casos participan iones metálicos que son cofactores inorgánicos.
La estructura del sitio activo tiene que ser más complementario al estado de transición que al sustrato mismo.
Aquí hay una analogía en donde se plantea que hay una barrita metálica que sería el sustrato, la barrita metálica se rompe en 2 trozos, eso sería el producto, y el estado de alta energía que va a ocurrir entremedio es cuando la barrita se está doblando, llega un momento que se rompe y ya no hay que aplicar más energía, eso sería el estado de alta energía. Se supone que la enzima seria un aparatito que tiene muchos Mg+2 y el sitio activo fuera exactamente complementario a la estructura del sustrato, entonces el sustrato se mete al sitio activo y queda muy bien unido, esto seria la complementariedad de todas las fuerzas que lo unen, pero eso no genera reacción porque ahí está perfectamente acomodado y no pasa nada. En el dibujo, lo de arriba no favorece la reacción, pero lo de abajo es clave, la enzima es complementaria al estado de transición cuando se une la barrita metálica a ese tipo de sitio activo, la forma induce a que se doble la barrita y adopta la estructura del estado de transición, el cual es perfectamente estabilizado por todas las interacciones magnéticas con la barrita metálica y ahí se rompe.
Ejemplo: aquí tenemos una enzima que se llama dihidrofolato-reductasa. Cofactor y sustrato: NADP+ (rojo), tetrahidrofolato (amarillo).
Aquí se muestra donde se une el tetrahidrofolato. Se unen uno al lado de otro en cierta orientación para favorecer la transferencia de electrones entre ellos.
Se hicieron ciertos experimentos para demostrar la importancia de la enzima en una reacción bimolecular.
En la siguiente reacción: reacciona un éster con un ácido carboxílico y se forma un anhídrido de ácido carboxílico (este grupo es muy importante en reacciones bimoleculares). En este experimento se trabajó con un grupo R en particular, midieron la velocidad y la constante de velocidad, dando el valor 1, la cual es una reacción bimolecular.
En la otra molécula inferior están los 2 grupos funcionales unidos, es una reacción bimolecular porque hay 2 grupos que reaccionan entre si, pero no es bimolecular como tal, aquí la constante de velocidad es 100 mil veces mayor que para la reacción bimolecular, se ve libre rotación en los 3 enlaces simples, construyendo una molécula cíclica lo cual restringe la libre rotación, produciendo un aumento de velocidad.
Esto ocurre cuando en una reacción bimolecular hay catálisis enzimática, los 2 sustratos ya no tienen que difundir en solución para chocar en la orientación adecuada, sino que ya están unidos en su sitio activo y en una orientación adecuada reaccionando rápidamente.
Aminoácidos que participan en la catálisis acido-base
Aquí se ven diferentes residuos de aminoácidos que pueden participar en mecanismos de catálisis acido-base:
El Glutamato y Aspartato tiene en su cadena lateral este tipo de grupo funcional, que cuando está protonado puede ceder el protón. En el mecanismo catalítico, el grupo que va a transferir el protón al sustrato que necesita ser protonado para poder reaccionar, va a ser de la enzima, la cual va a estar muy cerca del sustrato que se tiene que protonar. La transferencia del protón es directa, desde el grupo de la enzima que cede el protón hacia el grupo del sustrato que lo acepta, por lo cual no se necesita un pH ácido. En la catálisis química se logra protonar al sustrato simplemente aumentando la concentración de protones, habiendo una alta concentración de protones libres en la solución, esos tienden a unirse y protonan al sustrato para que reaccione.
En cambio cuando es un mecanismo con catálisis acido-base no se necesita una concentración alta de protones. La Lisina y Arginina en su forma protonada pueden ceder un protón, la Cisterna también puede ceder un protón a pesar de no tener características ácidas, la Histidina y Serina también. La serina es un caso particular porque el grupo hidroxilo no es de carácter ácido, la Tirosina también, ya que tiene un grupo fenólico, en donde el protón es débilmente ácido.
Ejemplo de mecanismo catalítico: reacción catalizada por la enzima enolasa, el 2-fosfoglicerato es transformado en fosfoenolpiruvato por la enolasa.
Aquí se ve el mecanismo catalítico, el 2-fosfoglicerato unido a la enolasa.
El Mg+2 polariza, es decir, atrae los electrones del oxígeno. Se ve 2-fosfoglicerato unido al sitio activo de la enolasa, donde también están los 2 iones Mg+2 (como son cofactores están en el sitio activo), la Glicina y Glutamato.
La Tripsina y Quimotripsina son enzimas proteolíticas que permiten la digestión de las proteínas. La especificidad de las enzimas proteolíticas es variable, la Quimotripsina tiene una especificidad diferente de la Tripsina. La Tripsina hidroliza un enlace peptídico detrás de Arginina y Lisina.
Dentro de las proteasas existen familias de proteasas, y estas son las que se llaman Serinas-proteasas, porque tiene un residuo de Serina que participa en el mecanismo catalítico.
Las enzimas proteolíticas son importantes porque no solo intervienen en la digestión, sino que también en los diferentes tejidos para degradar proteínas.
Aquí se ve la Quimotripsina:
En este estudio se utilizó un péptido pequeño como sustrato. También se ve la Serina 195 y Histidina 57.
Para plantear un mecanismo catalítico se hacen muchos estudios con análogos del sustrato, porque no se puede usar el sustrato directamente.
Generalmente una proteína esta en presencia de agua, sin embargo si no interviene la enzima catalizando la reacción un enlace peptídico no sufre hidrólisis, debido a que estos enlaces son muy estables.
¿Cómo se hace un análisis de aminoácido?
Primero se coloca la proteína y se le agrega HCL 6M, por lo tanto hay alta concentración de protones, eso se coloca en tubos, se le extrae el aire para que el oxigeno no degrade los aminoácidos, luego se calienta a 120 grados durante 1 o 2 días.
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